Malachitová zeleň. Do Česka se dostaly tisíce pstruhů se zakázanou látkou

Veterináři zjistili, že 10 500 pstruhů z Itálie mělo ve svalovině zakázanou leukomalachitovou zeleň, povolený limit vzorky přesáhly sedmkrát. Se zbytky této látky se veterináři v posledních letech setkávají spíše sporadicky, sdělil ČTK mluvčí Státní veterinární správy (SVS) Petr Vorlíček.

Malachitová zeleň se používá jako léčivo proti parazitům a plísním. V EU je její používání zakázané od roku 2000, nesmí se také používat ve Spojených státech amerických nebo v Kanadě. U savců včetně člověka může mít konzumace ryb s touto látkou potenciálně karcinogenní účinky, muselo by se jí ale sníst hodně.

"Na začátku dubna bylo přes 10 tisíc živých pstruhů duhových dovezeno z Itálie do společnosti Fish Market v Třeboni, kde došlo k jejich zpracování a následné distribuci několika odběratelům v České republice. Vakuově balený pstruh je již po datu spotřeby (8. - 15. 4. 2019), ale někteří zákazníci si mohli pstruhy zamrazit. Ryby je možné vrátit v místě nákupu," uvedl Vorlíček. Ryby podle něj následně prodával kromě Fish Marketu také řetězec Albert.

Protiplísňový prostředek

"Vyšetření na přítomnost leukomalachitové zeleně provedla akreditovaná laboratoř Státního veterinárního ústavu v Jihlavě. Testy zjistily, že vzorek svaloviny pstruha obsahuje 13,4 g/kg, kdy povolený limit je 2 g/kg," dodal mluvčí.

Leukomalachitová zeleň je degradačním produktem malachitové zeleně. Je tak podle něj pravděpodobné, že se látka na ryby použila před dovozem do ČR. Malachitová zeleň je protiplísňový prostředek. Protože je ale karcinogenní, nesmí se používat k ošetřování ryb určených k jídlu, pouze pro ošetření akvarijních a okrasných rybek.

ČTK
Zdroj: https://www.denik.cz/ekonomika/do-ceska-se-dostalo-na-10-tisic-pstruhu-z-italie-se-zakazanou-latkou-20190422.html


Malachitová zeleň je diamino-trifenylmetanové barvivo (skupina arylmetanových barviv). Vyrábí se kondenzací dimetylanilínu s benzaldehydem v prostředí dehydratačních látek (bezvodý chlorid zinečnatý, bezvodá kyselina šťavelová) a následnou oxidací oxidem olovičitým v prostředí kyseliny chlorovodíkové. Komerčně je dodávána nejčastěji jako oxalát. Vedle průmyslového využití jako barviva na kůži, papír a textil se již od 30. let používá jako fungicid a antiparazitikum v rybářské praxi pro prevenci a léčení chorob jiker a ryb.1,2

Používání malachitové zeleně v rybářství

Oxalát malachitové zeleně se v rybářské praxi používá ve formě krátkodobých a dlouhodobých protiplísňových a antiparazitárních koupelí ryb a protiplísňových koupelí jiker.

Mechanismus působení malachitové zeleně spočívá v zablokování dýchacích enzymů bakterií a parazitů. Fungicidní účinky malachitové zeleně jsou známy od poloviny třicátých let. V šedesátých letech se malachitová zeleň ukázala jako nejúčinnější prostředek proti jednobuněčným ektoparazitům, zejména proti Ichthyophthirius multifiliis. Význam malachitové zeleně ještě vzrostl, když se prokázala její účinnost na plíseň Saprolegnia sp. u jiker.3 Podrobné údaje o využití terapeutických vlastností malachitové zeleně jsou uvedeny v mnoha publikacích.4-10
V našich podmínkách se malachitová zeleň využívá zejména při nálezu Ichthyophthirius multifiliis, Ichthyobodo necator, Trichodina sp., Trichodinella sp., Chilodonella sp. a při povrchovém zaplísnění ryb. Dá se říci, že v některých situacích je téměř nenahraditelná. Malachitová zeleň se většinou aplikuje v koncentraci 0,5 mg.l-1 u kaprovitých ryb a 0,15 až 0,2 mg.l-1 u lososovitých ryb ve formě šestidenní koupele s každodenní výměnou lázně. Dále se malachitová zeleň používá v kombinované koupeli spolu s formaldehydem (0,25 mg.l-1 malachitové zeleně a 0,125 ml.l-1 36 až 38% vodného roztoku formaldehydu). V tomto případě se jedná o šestihodinovou nebo dvouhodinovou koupel, která se opakuje 2 až 3krát v 1 týdnu.9,10

Rizika používání malachitové zeleně

Akutní toxicita: Malachitová zeleň vykazuje vysokou toxicitu pro ryby, takže letální koncentrace pro ryby a doporučené terapeutické koncentrace jsou velmi blízké. Průběh otravy je velmi rychlý a u kapra obecného a pstruha duhového obdobný. Klinické příznaky jsou charakterizovány silným neklidem, ryby nekoordinovaně pojíždějí po lázni, pohybují se v horní polovině nádrže, vyskakují nad hladinu, u kaprů lze pozorovat nouzové dýchání. Následuje ztráta rovnováhy, útlum, agónie a úhyn. Patologickoanatomický obraz otravy ryb malachitovou zelení je charakterizován nazelenalým zabarvením a zvýšeným zahleněním kůže, žábry jsou edematózně zduřelé, zvýšeně zahleněné, zbarvené přípravkem. V dutině tělní lze pozorovat zvýšený nástřik cév a často zelené zabarvení vnitřních orgánů.11

Dalším významným problémem použití malachitové zeleně jsou velké rozdíly v její toxicitě v závislosti na původu. Tato skutečnost je potvrzena přehledem uvedeným v tabulce 1, kde jsou uvedeny pro pstruha duhového a kapra obecného hodnoty 48hLC50 a 48hLC5 malachitové zeleně pocházející z deseti zdrojů. Z této tabulky je také zřejmé, že letální koncentrace některých druhů malachitové zeleně jsou velmi blízké terapeutickým koncentracím. V případě malachitové zeleně dovezené z bývalého Sovětského svazu je dokonce doporučovaná terapeutická koncentrace vyšší než koncentrace letální.11,12 Při přípravě koupelí v malachitové zeleni je nutno také respektovat skutečnost, že organické a další redukující látky přítomné ve vodě výrazně snižují její toxicitu (a samozřejmě i účinnost).13

Z těchto důvodů je nutno věnovat pozornost výběru druhu použité malachitové zeleně, dodržovat dávkování a v každém případě před provedením koupele provést zkoušku snášenlivosti. Při této zkoušce je třeba použít vodu, ve které bude provedena koupel, a pokud možno dodržet hustotu ryb odpovídající obsádce.

Vedlejší negativní účinky na stav ošetřených ryb a jiker: Malachitová zeleň má vedle svých jedinečných terapeutických vlastností také řadu vedlejších negativních účinků na ošetřované ryby.

U pstruhů ošetřených hodinovou koupelí v malachitové zeleni o koncentraci 2 mg.l-1 byly v následném období pozorovány nižší hmotnostní přírůstky, vyšší mortalita a anemie.14 U pstruhů obecných, kteří byli v období raných stadií ošetřeni malachitovou zelení, byl zaznamenán vznik nádorů v žaludku, střevech a játrech.15

Při pokusech s kaprovitými rybami bylo prokázáno, že koncentrace malachitové zeleně 0,1 mg.l-1 vyvolala u pokusných ryb cytostatický syndrom, který se týkal dělení chromozomů.16 Další autoři17 uvádějí nepříznivý vliv malachitové zeleně na mitotickou aktivitu buněk žaberního epitelu a degenerativní změny v epitelu žaber. Při testech na tkáňových kulturách byly zaznamenány po 96hodinové expozici malachitové zeleni v koncentraci 0,5 až 20 mg.l-1 cytopatické změny, částečná vakuolizace cytoplazmy, granulace a rozpad většiny buněk.18 Aplikace malachitové zeleně negativně ovlivnila regeneraci poškozeného žaberního epitelu. Histopatologickým vyšetřením ryb po koupeli v malachitové zeleni byla prokázána všeobecná aktivace RES a výskyt zánětlivých buněk ve splavech sleziny. Čtrnáct dní po ošetření ryb malachitovou zelení byla pozorována zvýšená hemosideróza ve slezině a ledvině.19

U kaprů ošetřených malachitovou zelení byly histopatologickým vyšetřením zjištěny mírné regresivní změny na žábrách, mírné dystrofické změny v parenchymatózních tkáních a zvýšená aktivace makrofágů.20 U pstruhů duhových po koupelích v malachitové zeleni o koncentraci 6 mg.l-1 po dobu 40 minut opakovaných v týdenních intervalech byly pozorovány po třetí koupeli překrvení a fokální nekrózy v játrech. Na ultrastrukturální úrovni byla zjištěna mitochondriální poškození a dilatace endoplazmatického retikula. Na žábrách ošetřených ryb bylo pozorováno oddělování epiteliálních buněk, leukocytární infiltrace a nastupující nekróza lamelárních buněk. Frekvence těchto změn se zvyšovala s počtem opakování koupelí.21,22
Koupel v malachitové zeleni rovněž ovlivňuje krevní obraz ošetřených ryb. Šestidenní léčebná koupel kapra obecného v malachitové zeleni o koncentraci 0,5 mg.l-1 vyvolala u ošetřených ryb signifikantní změny v červeném krevním obrazu (snížení hematokritové hodnoty, snížení objemu erytrocytů, zvýšení střední barevné koncentrace) a v bílém krevním obrazu, kde došlo k poklesu absolutního i relativního počtu monocytů, dále bylo zjištěno snížení koncentrace celkových bílkovin v krevní plazmě.20 Podobné výsledky uvádějí i další autoři.14,23,24 Dlouhodobá expozice sumečků afrických (Clarias gariepinus) malachitové zeleni vedla k anemii a ke snížení počtu neutrofilních granulocytů.25

Koupelemi jiker pstruha duhového v malachitové zeleni byla prodloužena doba kulení váčkového plůdku o 5 až 8 dní ve srovnání s jikrami kontrolními. U larev vylíhnutých z ošetřených jiker byl pozorován zvýšený výskyt abnormalit (deformace hlavy, čelisti, pokřivení páteře nebo chybějící ploutve). I když procento jiker ve stadiu očních bodů, které byly ošetřeny malachitovou zelení, bylo větší ve srovnání s kontrolními (zřejmě jako výsledek redukce zaplísnění jiker vlivem koupele), nevyváží tato skutečnost ztráty larev, způsobené deformacemi následkem aplikace malachitové zeleně.15 U jiker ošetřených malachitovou zelení byly dále pozorovány chromozomální aberace,26 mitotické defekty a chromozomální zlomy.15
Kumulace a dlouhodobé přetrvávání malachitové zeleně a její redukované formy – leukobáze v ošetřených rybách: Bylo prokázáno, že malachitová zeleň má vysokou afinitu k živočišné tkáni . V praxi to znamená, že během koupele ryb v malachitové zeleni se tento preparát výrazně kumuluje v těle ryb. Uvádí se, že až 90 % přijaté malachitové zeleně se ve svalovině ryb kumuluje jako leukobáze (redukovaná nebarevná forma). Zatímco barevná forma se rychle vyloučí, leukobáze se vylučuje jen velmi pomalu.27 Proto se používání malachitové zeleně v některých státech povoluje pouze k ošetření akvarijních a okrasných druhů ryb.

Ve Spolkové republice Německo je stanoven hygienický limit obsahu malachitové zeleně 10 μg.kg-1 svaloviny ryb. V České republice nebyl hygienický limit pro obsah malachitové zeleně v rybách jako poživatinách stanoven, avšak v návodech na provedení koupelí je doporučeno dodržet šestiměsíční ochrannou lhůtu od provedení koupele ryb do jejich distribuce do tržní sítě.

Obsah reziduí malachitové zeleně v tkáních ryb se stanovuje vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Stanovuje se jak přímo barevná forma, tak i její bezbarvá leukoforma, která v tkáních přetrvává nejdéle. Stanovení se provádí buď ve dvou krocích – samostatně barevná forma a zvlášť suma barevné a leukoformy,27 nebo v jednom kroku simultánně barevná forma a leukoforma s použitím reakční chromatografie.28

V dostupných literárních pramenech jsou k dispozici údaje o dynamice vylučování malachitové zeleně z tkání ošetřených ryb. Tyto údaje ve shodě s našimi výsledky potvrzují, že malachitová zeleň v rybách přetrvává ve formě leukobáze dlouhou dobu.27,29,30 Doba potřebná k dosažení hodnoty 10 μg.kg-1 od provedené koupele závisí nejen na počátečním obsahu malachitové zeleně v těle ryb, ale také na rychlosti jejich růstu. U tržních ryb, které již nevykazují růst a u kterých byla po koupeli detekována malachitová zeleň v koncentraci 2000 μg.kg-1 svaloviny, bylo třeba k dosažení hodnoty 10 μg.kg-1 331 dnů. Naproti tomu u ryb s krátkou dobou růstu (12 měsíců) s počáteční hmotností 15,5 g bylo pro dosažení hodnoty 10 μg.kg-1 potřeba 146 dní a při dvojnásobné době růstu (24 měsíců) a počáteční hmotnosti ryb 38,3 g se tato doba prodloužila na 203 dnů.27 Obsah reziduí malachitové zeleně v těle ošetřených ryb závisí na koncentraci malachitové zeleně použité v koupeli. Po provedených koupelích v malachitové zeleni o koncentracích 0,4 mg.l-1, 1,2 mg.l-1 a 4,1 mg.l-1 byly zjištěny hodnoty reziduí v ošetřených rybách 150 μg.kg-1, 1000 μg.kg-1 a 1500 μg.kg-1. Opakované koupele ryb v malachitové zeleni vyvolávají kumulativní nárůst hodnot reziduí v rybách. Např. po koupeli ryb v malachitové zeleni o koncentraci 1 mg.l-1 provedené třikrát ve čtyřdenních intervalech byla zjištěna rezidua 1200 μg.kg-1, 3200 μg.kg-1 a 5800 μg.kg-1. Extrémně vysoký obsah malachitové zeleně v tkáních ryb byl zachycen po provedené kombinované koupeli (1 mg.l-1 malachitové zeleně a 0,02 ml.l-1 formalinu). Hlavní cestou vylučování malachitové zeleně u pstruhů duhových jsou játra a žlučový měchýř.27

Podobně vysoká kumulace a dlouhodobé přetrvávání malachitové zeleně ve formě leukobáze v těle ošetřených pstruhů duhových bylo zjištěno po dlouhodobé koupeli. Tržní pstruzi o průměrné hmotnosti 203,6 plus minus 40,3 g byli podrobeni šestidenní koupeli v malachitové zeleni o koncentraci 0,2 mg.l-1 s každodenní výměnou lázně. Bezprostředně po koupeli bylo zjištěno ve svalovině ryb 712 plus minus 383 μg.kg-1, v játrech 834 μg.kg-1 a v kůži 649 μg.kg-1 malachitové zeleně vyjádřené jako suma barevné formy a leukoformy, přičemž barevný podíl tvořil 30 až 60 % celkového množství.

Po uplynutí 8 týdnů od provedené koupele byl zjištěn výrazný pokles obsahu barevné formy malachitové zeleně (ve svalovině pod mez detekce, v kůži na hodnotu 11 μg.kg-1). Obsah leukoformy však byl velmi vysoký: ve svalovině 980 μg.kg-1, v kůži dokonce 1 600 μg.kg-1. Po uplynutí 6 měsíců od provedené koupele došlo k poklesu celkového obsahu malachitové zeleně ve svalovině na 60,4 plus minus 22,67 μg.kg-1 a u dvou vzorků ze sedmi byla zachycena také barevná forma malachitové zeleně v koncentraci 10 μg.kg-1. Podobně v kůži poklesl celkový obsah malachitové zeleně na hodnotu 30 μg.kg-1 a z tohoto množství činil obsah barevné formy 9 μg.kg-1.31 Znovuobjevení se barevné formy malachitové zeleně ve vzorcích ryb zřejmě souvisí s oxidací leukoformy, ke které může dojít v průběhu skladování vzorků.32 V následujícím období klesal obsah malachitové zeleně velmi pomalu. Malachitová zeleň, vyjádřená jako suma barevné formy a leukoformy, byla v tkáních ryb detekována ještě sedmý měsíc po provedené koupeli. Osm měsíců po koupeli byly provedené analýzy ještě pozitivní s výjimkou jater (svalovina 28,5 plus minus 14,4 μg.kg-1, kůže 10 μg.kg-1), po 10 měsících byl zaznamenán ještě záchyt malachitové zeleně ve svalovině 2,43 plus minus 4,61 μg.kg-1. Teprve po uplynutí 1 roku od provedené koupele byly výsledky všech provedených analýz negativní.

Uvedené údaje potvrzují, že malachitová zeleň má vysoce kumulativní charakter, a že její obsah v těle ošetřovaných ryb narůstá s počtem opakování koupelí a výší použité koncentrace. Dále byl potvrzen fakt, že bezprostředně po dlouhodobé koupeli (tj. koupel, která se v našich podmínkách na pstruhařstvích nejčastěji používá) obsah malachitové zeleně ve svalovině ošetřených ryb dosáhne více než sedmdesátinásobku povoleného hygienického limitu Spolkové republiky Německo. Navíc bylo prokázáno, že šestiměsíční ochranná lhůta doporučovaná od doby koupele do distribuce ryb do tržní sítě je naprosto nedostačující. Ve svalovině ošetřených ryb bylo zachyceno po 6 měsících od provedené koupele překročení limitu 10 μg.kg-1 až 9krát, v průměru 6krát, po 10 měsících průměr naměřených hodnot ve svalovině nepřekračoval daný limit, ale v jednom případě bylo ještě zachyceno mírné překročení limitu (1,2krát). Po 12 měsících od provedené koupele byly všechny analyzované vzorky svaloviny, jater a kůže negativní. Jestliže v tomto případě chceme s jistotou garantovat hygienickou nezávadnost ryb jako potravin, je nutné dodržet po koupeli ne půlroční, ale roční ochrannou lhůtu do distribuce ryb do tržní sítě. Pokud by byla provedena opakovaná koupel, je pravděpodobné, že se doba potřebná k poklesu obsahu malachitové zeleně pod hygienický limit ještě prodlouží.

Negativní účinky malachitové zeleně na terestrické organismy: Malachitová zeleň v koncentraci 0,025–0,4 μg.l-1 inhibuje průběh syntézy DNA u krysích hepatocytů jak neošetřených, tak ošetřených epidermálním růstovým faktorem. Předpokládá se, že cytotoxický a mitoinhibiční efekt hraje roli při vzniku nádorů. Účinek zeleně na buňky SHE (Syrian hamster embryo) se projevuje tvorbou volných radikálů; kataláza a glutathionperoxidáza snižují peroxidaci lipidů a poškozují DNA. Předpokládá se možná souvislost mezi genotoxicitou malachitové zeleně u SHE buněk a vznikem reaktivních volných radikálů.2

U hmyzu byly prokázány teratogenní, karcinogenní a mutagenní účinky.16 U krys bylo jako následek podávání malachitové zeleně prokázáno zvýšení počtu nádorů, výskyt defektního potomstva až do 9. generace a poškození kostry, srdce, ledvin a jater.15,33
Na druhé straně je pravdou, že studie o negativních účincích malachitové zeleně na teplokrevné organizmy, které jsou v literatuře k dispozici, ukazují negativní účinky malachitové zeleně jako následek její přímé aplikace. Údaje o účincích malachitové zeleně v její metabolizované formě – leukoformě v dostupné literatuře chybějí. Je však velmi pravděpodobné, že charakter účinků metabolitu malachitové zeleně – leukoformy je odlišný ve srovnání s účinky její barevné formy a konzumací ošetřených ryb spotřebitel přijímá převážně leukoformu.
Malachitová zeleň ve vodním prostředí: V literatuře existuje relativně málo údajů o negativních účincích malachitové zeleně na vodní prostředí. Uvádí se, že v přirozeném vodním biotopu přetrvává malachitová zeleň zhruba 80 dnů. Na jejím rozkladu se podílí hydrolýza.2Vliv malachitové zeleně na vodní organizmy (vodní bezobratlé a řasy) shrnuje práce.34
K odstranění malachitové zeleně z vody je možno využít aktivní uhlí.35,36Negativní vliv malachitové zeleně na funkci biologických filtrů nebyl prokázán.37

Závěr

Z výše uvedeného je zřejmé, že používat malachitovou zeleň paušálně a bez oprávněného důvodu (jako prevenci nebo její aplikací „zachraňovat“ zhoršenou kvalitu vody na líhních a rybochovných objektech) není možné. Na druhé straně je však třeba opakovaně zvážit její totální zákaz, neboť dosud není znám preparát, který by její použití plně nahradil. Striktní dodržování takového zákazu bude spojeno s výraznými ztrátami na líhních i rybochovných objektech.
Pokud bude malachitová zeleň k léčbě ryb nadále používána, je nutno provést její registraci ve smyslu zákona č. 79/1997 Sb., o léčivech ve znění pozdějších předpisů. Smyslem registrace léčiv je vymezení odpovědnosti za kvalitu, účinnost a neškodnost léků. Mluvíme-li o nutnosti používat v akvakultuře pouze registrovaná léčiva, je to z následujících důvodů:
– zajištění bezpečnosti používaných léčiv pro ryby
– zamezení výskytu reziduí používaných léčiv v tkáních ošetřených ryb, jejichž maso je určeno pro lidskou spotřebu
– zajištění kontroly vlivu léčiv na životní prostředí s cílem minimalizace rizik pro životní prostředí.

Ing. Jana Máchová